Gerando embriões in vitro a partir de células-tronco

“Guerra dos Clones”. Uma inovação tecnológica na ciência pode vir a permitir que um exército de clones seja criado em laboratório, utilizando apenas Células-tronco. O estudo demonstrou que é possível imitar a embriogénese in vitro cultivando em conjunto os três tipos de células-tronco derivadas de embriões (de camundongo) em sua fase inicial de desenvolvimento (blastocistos).

“Guerra dos Clones”. Uma inovação tecnológica na ciência pode vir a permitir que um exército de clones seja criado em laboratório, utilizando apenas Células-tronco. O estudo demonstrou que é possível imitar a embriogénese in vitro cultivando em conjunto os três tipos de células-tronco derivadas de embriões (de camundongo) em sua fase inicial de desenvolvimento (blastocistos). Células-tronco embrionárias (siglas ESCs em inglês, que dão origem ao embrião em si), e células trofoblásticas e da endoderme primitiva (siglas TSCs e XENCs, respectivamente) que contribuem para a implantação do embrião e a formação da placenta que irá alimentar o embrião. A técnica (apelidada ETX, devido às três linhagens celulares utilizadas) foram capazes de formar embriões com capacidade de implantação em camundongos. Os novos estudos vão buscar adicionar outras células necessárias para que o embrião seja levado a termo, gerando um animal completo. As possibilidades são enormes, assim como as implicações éticas. O que você acha? Clique no link para acessar a publicação. E não esqueça curta nossa página e compartilhe.

Implantation initiation of self-assembled embryo-like structures generated using three types of mouse blastocyst-derived stem cells.

Zhang S, Chen T, Chen N, Gao D, Shi B, Kong S, West RC, Yuan Y, Zhi M, Wei Q, Xiang J, Mu H, Yue L, Lei X, Wang X, Zhong L, Liang H, Cao S, Belmonte JCI, Wang H, Han J.

Nat Commun. 2019 Jan 30;10(1):496. doi: 10.1038/s41467-019-08378-9.PMID: 30700702

“Cell-in-cell” (Entosis): células do câncer canibais

Já ouviu falar em “Cell-in-cell” (ou Entosis)? Esse é um fenômeno análogo ao canibalismo, onde células contendo outra célula em seu interior são observadas, sendo frequente no câncer. Acredita-se que este mecanismo contribuiria com o fornecimento de nutrientes para a proliferação das células agressivas do câncer.

Já ouviu falar em “Cell-in-cell” (ou Entosis)? Esse é um fenômeno análogo ao canibalismo, onde células contendo outra célula em seu interior são observadas, sendo frequente no câncer. Acredita-se que este mecanismo contribuiria com o fornecimento de nutrientes para a proliferação das células agressivas do câncer. Provavelmente você já ouviu falar em morte celular programada (ou apoptose), responsável em grande parte pela morte natural das células de nosso corpo, que estão sendo substituídas por novas células. A apoptose pode ser considerada uma forma de “suicídio celular”, nos casos em que ela é desencadeada por sinais internos da própria célula. No entanto, outras formas de morte celular podem ocorrer em situações patológicas. Por exemplo, células infectadas por vírus morrem quando são atacadas pelo sistema imunológico, neste caso sendo “assassinadas”. Mas existem outras formas de morte celular intrigantes e pouco estudadas que envolvem a internalização de uma célula saudável por uma célula vizinha. No câncer, as células de alguns tipos de câncer (como o melanoma, ou câncer de pele) podem ativamente englobar células do sistema imune, “alimentando-se” de seus nutrientes e favorecendo a proliferação e a progressão do câncer. Outros tipos de câncer (como o de mama) podem interagir com células do mesmo tipo que elas (epiteliais), mas saudáveis. Neste caso (Entosis), as células saudáveis são as que entram nas células tumorais. Também neste caso, os nutrientes servem para alimentar o câncer e, ainda por cima, os cromossomos da célula internalizada podem contribuir para a poliploidia da célula tumoral, conferindo vantagens proliferativas. Clique no link abaixo para acessar uma revisão sobre o assunto. Interessante, não? Curta nossa página e compartilhe.

Consequências do canibalismo e da entosis. O englobamento de uma célula normal por uma célula do câncer, alimenta esta última com nutriente essenciais para que ela continue proliferando, além de poder causar alterações funcionais ou genéticas (ploidias e aneuploidias), conferindo um fenótipo mais agressivo para a célula.

Cell-in-cell phenomena in cancer.

Fais S, Overholtzer M.

Nat Rev Cancer. 2018 Dec;18(12):758-766. doi: 10.1038/s41568-018-0073-9. Review.PMID: 30420767

Imunoterapia de células CAR-T contra o câncer, direto do laboratório para o paciente

Incrível! Já imaginou se pudéssemos ter, pronto para uso, um frasco com células do sistema imune modificadas para atacar um determinado tipo de câncer num paciente? Pois é, um estudo mostrou que isso pode vir a se tornar realidade. A imunoterapia baseada em células T modificadas geneticamente (as CAR-T, das quais falamos na postagem anterior) que já vem curando muitos pacientes com câncer que não tinham mais esperança pode ter seu uso facilitado pela nova abordagem.

Incrível! Já imaginou se pudéssemos ter, pronto para uso, um frasco com células do sistema imune modificadas para atacar um determinado tipo de câncer num paciente? Pois é, um estudo mostrou que isso pode vir a se tornar realidade. A imunoterapia baseada em células T modificadas geneticamente (as CAR-T, das quais falamos na postagem anterior) que já vem curando muitos pacientes com câncer que não tinham mais esperança pode ter seu uso facilitado pela nova abordagem. Na abordagem convencional, as células T tem que ser coletadas de um paciente, modificadas e, em seguida, infundidas de volta no paciente. No entanto, algumas pessoas com câncer não têm células T suficientes para se submeter à terapia. A nova abordagem não depende da coleta de pacientes, tornando estas terapias mais acessíveis e eficazes. O truque é utilizar uma Célula-tronco Pluripotente, ou seja, que consegue dar origem a qualquer tipo de célula do corpo humano. Estas células são modificadas geneticamente, de forma que ela pode originar in vitro as células CAR-T diretamente. A ideia é que as células poderiam ser produzidas em quantidade suficiente e armazenadas para uso imediato para tratar os pacientes. Clique no link abaixo para acessar o artigo original. E não esqueça! Curta nossa página Ciência, Tecnologia e Inovação.

Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.

Montel-Hagen A, Seet CS, Li S, Chick B, Zhu Y, Chang P, Tsai S, Sun V, Lopez S, Chen HC, He C, Chin CJ, Casero D, Crooks GM.

Cell Stem Cell. 2019 Jan 4. pii: S1934-5909(18)30601-5. doi: 10.1016/j.stem.2018.12.011. [Epub ahead of print]PMID: 30661959

Descrevendo seus Materiais e Métodos

Um desafio pra todo cientista que está começando é descrever adequadamente a seção de Materiais e Métodos, de forma que quem a lê possa reproduzir seus experimentos com exatidão.

Final de semana. Que tal descontrair? Um desafio pra todo cientista que está começando é descrever adequadamente a seção de Materiais e Métodos, de forma que quem a lê possa reproduzir seus experimentos com exatidão. O segredo é tentar se abstrair do seu conhecimento para escrever, de forma que uma pessoa que não tem conhecimento nenhum possa reproduzir passo a passo. Veja este vídeo em que as crianças sofrem tentando descrever a simples tarefa de preparar um sanduíche de manteiga de amendoim e geleia. O pai faz exatamente isso, finge completa ignorância com as coisas mais básicas, só assim seus filhos entendem que tem de ser mais específicos e detalhistas em suas instruções. Interessante, não? Não esqueça de curtir a nossa página do FaceBook Ciência, Tecnologia e Inovação. Ótimo final de semana!

“FISSEQ”, olhando o transcriptoma da célula ao microscópio.

Já imaginou se ao olhar no microscópio você pudesse saber qual o transcriptoma de cada célula na imagem? Conheça o “FISSEQ” (Fluorescent in situ sequencing), uma tecnologia inovadora que une a informação posicional/estrutural da microscopia de fluorescência com a informação molecular do sequenciamento de nova geração (NGS).

A técnica chamada “FISSEQ” (Fluorescent in situ sequencing) é uma tecnologia inovadora que une a informação posicional/estrutural da microscopia de fluorescência com a informação molecular do sequenciamento de nova geração (NGS).

O 1o vídeo mostra uma representação do sequenciamento dos RNAs mensageiros numa célula. A cada ciclo do processo, à medida que as bases vão sendo sequenciadas in situ, uma imagem é obtida com uma cor específica indicando qual base foi adicionada. Para ilustrar, as várias imagens obtidas em sequência são empilhadas verticalmente, de forma a representar a sequência de bases do RNA mensageiro presente naquela determinada posição da célula.

Representação do sequenciamento dos RNAs mensageiros numa célula.

O 2o vídeo mostra que o sequenciamento é realizados em paralelo para todas as células que aparecem nas imagens de microscopia, guardando a informação posicional das células.

Sequenciamento em paralelo para todas as células nas imagens de microscopia.

O 3o vídeo mostra que cortes histológicos de um órgão (cérebro de um camundongo neste caso) pode ter o transcriptoma de suas células determinado. A quantidade e a posição sub-celular de dezenas a milhares de RNA mensageiros podem ser identificados em cada uma das células de um tecido.

O último é o vídeo dos autores do artigo e inventores da técnica.

Construção e sequenciamento da biblioteca FISSEQ.

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nihms619650f1.jpg
Visão geral esquemática da construção e sequenciamento da biblioteca FISSEQ. (a) Células ou tecidos fixos são permeabilizados e transcritos inversamente in situ na presença de hexâmeros aleatórios marcados com sequência de aminoallyl dUTP e adaptador. Os fragmentos de cDNA são fixados à matriz proteica celular utilizando um agente de crosslink e circularizados após degradação do RNA. Os moldes circulares são amplificados utilizando primers RCA complementares à sequência do adaptador na presença de aminoallyl dUTP e estavelmente fixados. Os amplicons de ácido nucléico nas células estão então prontos para sequenciamento e geração de imagens (fibroblastos mostrados). (b) Cada amplicon contém numerosas cópias em tandem do cDNA e da sequência do adaptador. Um primer se anela às sequencias adaptadoras em amplicons individuais e sondas fluorescentes são utilizadas para realizar o sequenciamento por ligação (método SOLID). Todo o processo é repetido usando quatro outros primers de seqüenciamento com um deslocamento para identificar as sequencia de bases.

Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues.

Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, Kalhor R, Ferrante TC, Terry R, Turczyk BM, Yang JL, Lee HS, Aach J, Zhang K, Church GM.

Nat Protoc. 2015 Mar;10(3):442-58. doi: 10.1038/nprot.2014.191. Epub 2015 Feb 12.PMID: 25675209

CAR-T cells: Uma imunoterapia revolucionária contra o câncer

Conheça a imunoterapia com células T modificadas que está curando pacientes com câncer que eram considerados incuráveis. A chamada terapia com células CAR-T (do inglês, chimeric antigen receptor) envolve a coleta de células T de um paciente e sua modificação (por técnicas de engenharia genética) com um receptor que as ajuda a reconhecer e destruir as células cancerígenas. Em seguida, estas células CAR-T são transfundidas de volta para o paciente

Conheça a imunoterapia com células T modificadas que está curando pacientes com câncer que eram considerados incuráveis. A chamada terapia com células CAR-T (do inglês, chimeric antigen receptor) envolve a coleta de células T de um paciente e sua modificação (por técnicas de engenharia genética) com um receptor que as ajuda a reconhecer e destruir as células cancerígenas. Em seguida, estas células CAR-T são transfundidas de volta para o paciente. A abordagem vem sendo comumente usada em neoplasias hematológicas (câncer do sangue), como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), linfoma e mieloma múltiplo (MM), pois todos estes tipos de cancer tem origem em linfócitos B (outro tipo de célula do sangue) que possuem a proteína CD19 em sua superfície. O CD19 serve como antígeno para que o mesmo receptor quimérico possa ser utilizado em todos esses tipos de câncer. Apesar do enorme potencial, as células T projetadas nem sempre funcionam bem e o tratamento é muito caro (podendo custar até um milhão de dólares), porque é feito sob medida para cada paciente. Clique no link abaixo para acessar uma revisão ilustrada de livre acesso explicando a abordagem. E não esqueça! Curta nossa página Ciência, Tecnologia e Inovação.

The application of CAR-T cell therapy in hematological malignancies: advantages and challenges.

Zhao Z, Chen Y, Francisco NM, Zhang Y, Wu M.

Acta Pharm Sin B. 2018 Jul;8(4):539-551. doi: 10.1016/j.apsb.2018.03.001. Epub 2018 Apr 5. Review.PMID: 30109179

“Perturb-Seq”, uma revolução na Biologia de Sistemas

Uma verdadeira revolução na maneira como a Biologia de Sistemas será abordada experimentalmente esta por vir! Conheça o “Perturb-Seq”, uma a técnica que permite avaliar o efeito do knockout de milhares de genes no transcriptoma celular, de forma simultânea.

Na postagem anterior, falamos sobre a revolução que a técnica chamada Droplet-seq trouxe ao permitir a obtenção do transcriptoma de dezenas de milhares de células únicas, de maneira rápida, simples e econômica. O “Perturb-Seq” é um desdobramentos do Droplet-Seq. A capacidade de gerar transcriptomas de células individuais em grande escala (100-200 mil células) permite que o efeito do knockout de milhares de genes possam ser avaliados em paralelo. Para isso, bibliotecas genéticas contendo “pools” de construções baseadas na técnica CRISPR (famosa técnica de edição de genomas) são introduzidas em células que terão seus transcriptomas determinados pela técnica do Droplet-Seq. Cada construção entra independentemente numa única célula, promovendo o knockout de um único gene. Assim, milhares de genes do genoma são knockouteados em milhares de células distintas. As alterações observadas em seus transcriptomas permitem inferir a função destes genes. Trata-se de um enorme salto na capacidade de entender a função dos genes no mar de complexidade dos milhares de genes sendo expressos nos mais variados tipos de células. Acesse o artigo original abaixo:

Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens.

Dixit A, Parnas O, Li B, Chen J, Fulco CP, Jerby-Arnon L, Marjanovic ND, Dionne D, Burks T, Raychowdhury R, Adamson B, Norman TM, Lander ES, Weissman JS, Friedman N, Regev A.

Cell. 2016 Dec 15;167(7):1853-1866.e17. doi: 10.1016/j.cell.2016.11.038.PMID: 27984732

“Droplet-Seq”: sequenciando o transcriptoma de dezenas de milhares de células, simultaneamente

Conheça a tecnologia do “Droplet-Seq” que está revolucionando a ciência. O Drop-seq analisa transcritos de mRNA de milhares de células individuais simultaneamente, lembrando a célula de origem dos transcritos.

De tempos em tempos a ciência é presenteada com inovações tecnológicas disruptivas. Foi assim com as novas tecnologias de sequenciamento de DNA (ou Next Generation Sequencing, ou NGS), que permitiram que o genoma humano fosse sequenciado num único equipamento e em poucas horas e por poucos milhares de dólares, ao invés dos 10 anos e 3 bilhões de dólares gastos pelo projeto do genoma humano e das centenas de sequenciadores clássicos (baseados no método de Sanger) utilizados pelos centros de sequenciamento. Com a tecnologia NGS, a capacidade de gerar bibliotecas para o sequenciamento do conjunto total de RNAs mensageiros (mRNAs) transcrito a partir dos genes ativos de uma única célula (seu transcriptoma, que codifica todas as proteínas da célula) permitiu que novas e importantes questões fossem feitas e respondidas. Apesar destes grandes avanços, até recentemente, na prática a possibilidade de se gerar bibliotecas de células únicas se restringia a apenas algumas dezenas ou centenas de células. A tecnologia do” Droplet-Seq” permite a geração de transcriptomas individuais de MILHARES de células de forma incrivelmente simples! Para isso, as células de um tecido são encapsuladas em pequenas gotículas, juntamente com todos os reagentes necessários para geração e identificação (com um “barcode” de DNA) dos cDNA derivados dos mRNAs de cada célula. Isto permite, por exemplo, que os pesquisadores saibam quais as células que estão presentes em um tumor (células do próprio câncer, do estroma, do sistema imune, etc), de forma que possam entender a biologia deste microambiente extremamente complexo e, eventualmente, descobrir novos caminhos para atacar o tumor e curar o paciente. Veja mais no artigo original abaixo (com abstracts gráficos e em vídeo):

https://marlin-prod.literatumonline.com/cms/attachment/4ee6c037-2624-4c29-9cff-2aa7eb7cbd4a/gr1_lrg.jpg
(A) Esquema de código de barras Drop-Seq. Um tecido complexo é dissociado em células individuais, que são então encapsuladas em gotículas juntamente com micropartículas (círculos cinzas) que fornecem primers codificados por códigos de barras. Cada célula é lisada dentro de uma gotícula; seus mRNAs se ligam aos primers da microparticula companheira. Os mRNAs são transcritos reversamente em cDNAs, gerando um conjunto de micropartículas chamadas “transcriptomas unicelulares ligados a micropartículas” (“single-cell transcriptomes attached to microparticles” ou STAMPs). Os STAMPs com código de barras podem então ser amplificados em conjuntos para sequenciamento (mRNA-seq) para analisar qualquer número desejado de células individuais.
(B) Sequência de iniciadores na micropartícula. Os primers em todas as esferas contêm uma seqüência comum (“PCR handle”) para permitir a amplificação por PCR após a formação do STAMP. Cada micropartícula contém mais de 10^8 primers individuais que compartilham o mesmo “cell barcode” (C), mas possuem diferentes identificadores moleculares (UMIs), permitindo que os transcritos de RNAm sejam contados digitalmente (D). Uma sequência oligo dT de 30 pb está presente no final de todas as sequências para captura dos mRNAs.
(C) Síntese do código de barras “Split-and-pool” da célula. Para gerar o código de barras da célula, o conjunto de micropartículas é repetidamente dividido em quatro reações de síntese de oligonucleótidos de tamanho igual, às quais uma das quatro bases do DNA é adicionada, e depois reunidas após cada ciclo, num total de 12 ciclos. O código de barras sintetizado em qualquer microparticula individual reflete o caminho único através da série de reações de síntese. O resultado é um conjunto de micropartículas, cada uma possuindo uma de 4^12 (16.777.716) sequências possíveis.
(D) Síntese do identificador molecular único (UMI). Após a conclusão dos ciclos de síntese “split-and-pool”, todas as micropartículas são submetidas a oito ciclos de síntese degenerada com todas as quatro bases de DNA disponíveis durante cada ciclo, de forma que cada iniciador individual recebe uma das 4^8 (65.536) sequências possíveis (UMIs).

Cell 2015 161, 1202-1214DOI: 10.1016/j.cell.2015.05.00

Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA.

Cell. 2015 May 21;161(5):1202-1214. doi: 10.1016/j.cell.2015.05.002.PMID: 26000488