“Droplet-Seq”: sequenciando o transcriptoma de dezenas de milhares de células, simultaneamente

Conheça a tecnologia do “Droplet-Seq” que está revolucionando a ciência. O Drop-seq analisa transcritos de mRNA de milhares de células individuais simultaneamente, lembrando a célula de origem dos transcritos.

De tempos em tempos a ciência é presenteada com inovações tecnológicas disruptivas. Foi assim com as novas tecnologias de sequenciamento de DNA (ou Next Generation Sequencing, ou NGS), que permitiram que o genoma humano fosse sequenciado num único equipamento e em poucas horas e por poucos milhares de dólares, ao invés dos 10 anos e 3 bilhões de dólares gastos pelo projeto do genoma humano e das centenas de sequenciadores clássicos (baseados no método de Sanger) utilizados pelos centros de sequenciamento. Com a tecnologia NGS, a capacidade de gerar bibliotecas para o sequenciamento do conjunto total de RNAs mensageiros (mRNAs) transcrito a partir dos genes ativos de uma única célula (seu transcriptoma, que codifica todas as proteínas da célula) permitiu que novas e importantes questões fossem feitas e respondidas. Apesar destes grandes avanços, até recentemente, na prática a possibilidade de se gerar bibliotecas de células únicas se restringia a apenas algumas dezenas ou centenas de células. A tecnologia do” Droplet-Seq” permite a geração de transcriptomas individuais de MILHARES de células de forma incrivelmente simples! Para isso, as células de um tecido são encapsuladas em pequenas gotículas, juntamente com todos os reagentes necessários para geração e identificação (com um “barcode” de DNA) dos cDNA derivados dos mRNAs de cada célula. Isto permite, por exemplo, que os pesquisadores saibam quais as células que estão presentes em um tumor (células do próprio câncer, do estroma, do sistema imune, etc), de forma que possam entender a biologia deste microambiente extremamente complexo e, eventualmente, descobrir novos caminhos para atacar o tumor e curar o paciente. Veja mais no artigo original abaixo (com abstracts gráficos e em vídeo):

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(A) Esquema de código de barras Drop-Seq. Um tecido complexo é dissociado em células individuais, que são então encapsuladas em gotículas juntamente com micropartículas (círculos cinzas) que fornecem primers codificados por códigos de barras. Cada célula é lisada dentro de uma gotícula; seus mRNAs se ligam aos primers da microparticula companheira. Os mRNAs são transcritos reversamente em cDNAs, gerando um conjunto de micropartículas chamadas “transcriptomas unicelulares ligados a micropartículas” (“single-cell transcriptomes attached to microparticles” ou STAMPs). Os STAMPs com código de barras podem então ser amplificados em conjuntos para sequenciamento (mRNA-seq) para analisar qualquer número desejado de células individuais.
(B) Sequência de iniciadores na micropartícula. Os primers em todas as esferas contêm uma seqüência comum (“PCR handle”) para permitir a amplificação por PCR após a formação do STAMP. Cada micropartícula contém mais de 10^8 primers individuais que compartilham o mesmo “cell barcode” (C), mas possuem diferentes identificadores moleculares (UMIs), permitindo que os transcritos de RNAm sejam contados digitalmente (D). Uma sequência oligo dT de 30 pb está presente no final de todas as sequências para captura dos mRNAs.
(C) Síntese do código de barras “Split-and-pool” da célula. Para gerar o código de barras da célula, o conjunto de micropartículas é repetidamente dividido em quatro reações de síntese de oligonucleótidos de tamanho igual, às quais uma das quatro bases do DNA é adicionada, e depois reunidas após cada ciclo, num total de 12 ciclos. O código de barras sintetizado em qualquer microparticula individual reflete o caminho único através da série de reações de síntese. O resultado é um conjunto de micropartículas, cada uma possuindo uma de 4^12 (16.777.716) sequências possíveis.
(D) Síntese do identificador molecular único (UMI). Após a conclusão dos ciclos de síntese “split-and-pool”, todas as micropartículas são submetidas a oito ciclos de síntese degenerada com todas as quatro bases de DNA disponíveis durante cada ciclo, de forma que cada iniciador individual recebe uma das 4^8 (65.536) sequências possíveis (UMIs).

Cell 2015 161, 1202-1214DOI: 10.1016/j.cell.2015.05.00

Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA.

Cell. 2015 May 21;161(5):1202-1214. doi: 10.1016/j.cell.2015.05.002.PMID: 26000488

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