“FISSEQ”, olhando o transcriptoma da célula ao microscópio.

Já imaginou se ao olhar no microscópio você pudesse saber qual o transcriptoma de cada célula na imagem? Conheça o “FISSEQ” (Fluorescent in situ sequencing), uma tecnologia inovadora que une a informação posicional/estrutural da microscopia de fluorescência com a informação molecular do sequenciamento de nova geração (NGS).

A técnica chamada “FISSEQ” (Fluorescent in situ sequencing) é uma tecnologia inovadora que une a informação posicional/estrutural da microscopia de fluorescência com a informação molecular do sequenciamento de nova geração (NGS).

O 1o vídeo mostra uma representação do sequenciamento dos RNAs mensageiros numa célula. A cada ciclo do processo, à medida que as bases vão sendo sequenciadas in situ, uma imagem é obtida com uma cor específica indicando qual base foi adicionada. Para ilustrar, as várias imagens obtidas em sequência são empilhadas verticalmente, de forma a representar a sequência de bases do RNA mensageiro presente naquela determinada posição da célula.

Representação do sequenciamento dos RNAs mensageiros numa célula.

O 2o vídeo mostra que o sequenciamento é realizados em paralelo para todas as células que aparecem nas imagens de microscopia, guardando a informação posicional das células.

Sequenciamento em paralelo para todas as células nas imagens de microscopia.

O 3o vídeo mostra que cortes histológicos de um órgão (cérebro de um camundongo neste caso) pode ter o transcriptoma de suas células determinado. A quantidade e a posição sub-celular de dezenas a milhares de RNA mensageiros podem ser identificados em cada uma das células de um tecido.

O último é o vídeo dos autores do artigo e inventores da técnica.

Construção e sequenciamento da biblioteca FISSEQ.

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Object name is nihms619650f1.jpg
Visão geral esquemática da construção e sequenciamento da biblioteca FISSEQ. (a) Células ou tecidos fixos são permeabilizados e transcritos inversamente in situ na presença de hexâmeros aleatórios marcados com sequência de aminoallyl dUTP e adaptador. Os fragmentos de cDNA são fixados à matriz proteica celular utilizando um agente de crosslink e circularizados após degradação do RNA. Os moldes circulares são amplificados utilizando primers RCA complementares à sequência do adaptador na presença de aminoallyl dUTP e estavelmente fixados. Os amplicons de ácido nucléico nas células estão então prontos para sequenciamento e geração de imagens (fibroblastos mostrados). (b) Cada amplicon contém numerosas cópias em tandem do cDNA e da sequência do adaptador. Um primer se anela às sequencias adaptadoras em amplicons individuais e sondas fluorescentes são utilizadas para realizar o sequenciamento por ligação (método SOLID). Todo o processo é repetido usando quatro outros primers de seqüenciamento com um deslocamento para identificar as sequencia de bases.

Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues.

Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, Kalhor R, Ferrante TC, Terry R, Turczyk BM, Yang JL, Lee HS, Aach J, Zhang K, Church GM.

Nat Protoc. 2015 Mar;10(3):442-58. doi: 10.1038/nprot.2014.191. Epub 2015 Feb 12.PMID: 25675209

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