“CellectAb”: identificando marcadores de células-tronco Tumorais

Conheça a inovadora metodologia denominada CellectAb que permite a rápida identificação de marcadores presentes na superfície de Células-tronco Tumorais, com a geração simultânea de potentes anticorpos específicos que podem ser prontamente utilizados em diversas abordagens terapêuticas contra o câncer.

Conheça a inovadora metodologia denominada CellectAb que permite a rápida identificação de marcadores presentes na superfície de Células-tronco Tumorais, com a geração simultânea de potentes anticorpos específicos que podem ser prontamente utilizados em diversas abordagens terapêuticas contra o câncer. A técnica é uma adaptação da chamada “Phage-display” e utiliza uma biblioteca com uma diversidade enorme de fragmentos Fab (a região do anticorpo que liga ao antígeno), cada um expresso na superfície de um vírus bacteriófago. A biblioteca de vírus é inicialmente misturada com células que não são de interesse, para remover os vírus com Fabs que se ligam a estas células. Em seguida, os virus que não se ligaram às células são misturados com a população de células de interesse (células-tronco tumorais). Os bacteriófagos que se ligam a estas células são selecionados e as regiões Fab são identificadas por sequênciamento, sendo então utilizadas para identificar as proteínas às quais elas se ligam. O processo é rápido e econômico, levando apenas uma semana para identificar os anticorpos, e um mês para produzi-los em quantidade. Uma redução significativa, comparado às 30 semanas utilizadas pelos métodos usuais. Ainda, o fato de se obter a sequência codificadora do fragmento FAB, permite que ela seja utilizada em outras abordagens terapêuticas, como os anticorpos bi-específicos ou as CAR-T Cells (já mencionadas em uma postagem anterior). A abordagem irá acelerar a pesquisa na área e vai nos ajudar na luta contra o câncer. Curta a nossa página Ciência, Tecnologia e Inovação Brasil. e compartilhe a postagem. https://www.nature.com/articles/s41598-018-37462-1

A rapid in vitro methodology for simultaneous target discovery and antibody generation against functional cell subpopulations.

Nixon AML, Duque A, Yelle N, McLaughlin M, Davoudi S, Pedley NM, Haynes J, Brown KR, Pan J, Hart T, Gilbert PM, Singh SK, O’Brien CA, Sidhu SS, Moffat J.

Sci Rep. 2019 Jan 29;9(1):842. doi: 10.1038/s41598-018-37462-1. PMID: 30696911

Gerando embriões in vitro a partir de células-tronco

“Guerra dos Clones”. Uma inovação tecnológica na ciência pode vir a permitir que um exército de clones seja criado em laboratório, utilizando apenas Células-tronco. O estudo demonstrou que é possível imitar a embriogénese in vitro cultivando em conjunto os três tipos de células-tronco derivadas de embriões (de camundongo) em sua fase inicial de desenvolvimento (blastocistos).

“Guerra dos Clones”. Uma inovação tecnológica na ciência pode vir a permitir que um exército de clones seja criado em laboratório, utilizando apenas Células-tronco. O estudo demonstrou que é possível imitar a embriogénese in vitro cultivando em conjunto os três tipos de células-tronco derivadas de embriões (de camundongo) em sua fase inicial de desenvolvimento (blastocistos). Células-tronco embrionárias (siglas ESCs em inglês, que dão origem ao embrião em si), e células trofoblásticas e da endoderme primitiva (siglas TSCs e XENCs, respectivamente) que contribuem para a implantação do embrião e a formação da placenta que irá alimentar o embrião. A técnica (apelidada ETX, devido às três linhagens celulares utilizadas) foram capazes de formar embriões com capacidade de implantação em camundongos. Os novos estudos vão buscar adicionar outras células necessárias para que o embrião seja levado a termo, gerando um animal completo. As possibilidades são enormes, assim como as implicações éticas. O que você acha? Clique no link para acessar a publicação. E não esqueça curta nossa página e compartilhe.

Implantation initiation of self-assembled embryo-like structures generated using three types of mouse blastocyst-derived stem cells.

Zhang S, Chen T, Chen N, Gao D, Shi B, Kong S, West RC, Yuan Y, Zhi M, Wei Q, Xiang J, Mu H, Yue L, Lei X, Wang X, Zhong L, Liang H, Cao S, Belmonte JCI, Wang H, Han J.

Nat Commun. 2019 Jan 30;10(1):496. doi: 10.1038/s41467-019-08378-9.PMID: 30700702

“FISSEQ”, olhando o transcriptoma da célula ao microscópio.

Já imaginou se ao olhar no microscópio você pudesse saber qual o transcriptoma de cada célula na imagem? Conheça o “FISSEQ” (Fluorescent in situ sequencing), uma tecnologia inovadora que une a informação posicional/estrutural da microscopia de fluorescência com a informação molecular do sequenciamento de nova geração (NGS).

A técnica chamada “FISSEQ” (Fluorescent in situ sequencing) é uma tecnologia inovadora que une a informação posicional/estrutural da microscopia de fluorescência com a informação molecular do sequenciamento de nova geração (NGS).

O 1o vídeo mostra uma representação do sequenciamento dos RNAs mensageiros numa célula. A cada ciclo do processo, à medida que as bases vão sendo sequenciadas in situ, uma imagem é obtida com uma cor específica indicando qual base foi adicionada. Para ilustrar, as várias imagens obtidas em sequência são empilhadas verticalmente, de forma a representar a sequência de bases do RNA mensageiro presente naquela determinada posição da célula.

Representação do sequenciamento dos RNAs mensageiros numa célula.

O 2o vídeo mostra que o sequenciamento é realizados em paralelo para todas as células que aparecem nas imagens de microscopia, guardando a informação posicional das células.

Sequenciamento em paralelo para todas as células nas imagens de microscopia.

O 3o vídeo mostra que cortes histológicos de um órgão (cérebro de um camundongo neste caso) pode ter o transcriptoma de suas células determinado. A quantidade e a posição sub-celular de dezenas a milhares de RNA mensageiros podem ser identificados em cada uma das células de um tecido.

O último é o vídeo dos autores do artigo e inventores da técnica.

Construção e sequenciamento da biblioteca FISSEQ.

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nihms619650f1.jpg
Visão geral esquemática da construção e sequenciamento da biblioteca FISSEQ. (a) Células ou tecidos fixos são permeabilizados e transcritos inversamente in situ na presença de hexâmeros aleatórios marcados com sequência de aminoallyl dUTP e adaptador. Os fragmentos de cDNA são fixados à matriz proteica celular utilizando um agente de crosslink e circularizados após degradação do RNA. Os moldes circulares são amplificados utilizando primers RCA complementares à sequência do adaptador na presença de aminoallyl dUTP e estavelmente fixados. Os amplicons de ácido nucléico nas células estão então prontos para sequenciamento e geração de imagens (fibroblastos mostrados). (b) Cada amplicon contém numerosas cópias em tandem do cDNA e da sequência do adaptador. Um primer se anela às sequencias adaptadoras em amplicons individuais e sondas fluorescentes são utilizadas para realizar o sequenciamento por ligação (método SOLID). Todo o processo é repetido usando quatro outros primers de seqüenciamento com um deslocamento para identificar as sequencia de bases.

Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues.

Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, Kalhor R, Ferrante TC, Terry R, Turczyk BM, Yang JL, Lee HS, Aach J, Zhang K, Church GM.

Nat Protoc. 2015 Mar;10(3):442-58. doi: 10.1038/nprot.2014.191. Epub 2015 Feb 12.PMID: 25675209

“Perturb-Seq”, uma revolução na Biologia de Sistemas

Uma verdadeira revolução na maneira como a Biologia de Sistemas será abordada experimentalmente esta por vir! Conheça o “Perturb-Seq”, uma a técnica que permite avaliar o efeito do knockout de milhares de genes no transcriptoma celular, de forma simultânea.

Na postagem anterior, falamos sobre a revolução que a técnica chamada Droplet-seq trouxe ao permitir a obtenção do transcriptoma de dezenas de milhares de células únicas, de maneira rápida, simples e econômica. O “Perturb-Seq” é um desdobramentos do Droplet-Seq. A capacidade de gerar transcriptomas de células individuais em grande escala (100-200 mil células) permite que o efeito do knockout de milhares de genes possam ser avaliados em paralelo. Para isso, bibliotecas genéticas contendo “pools” de construções baseadas na técnica CRISPR (famosa técnica de edição de genomas) são introduzidas em células que terão seus transcriptomas determinados pela técnica do Droplet-Seq. Cada construção entra independentemente numa única célula, promovendo o knockout de um único gene. Assim, milhares de genes do genoma são knockouteados em milhares de células distintas. As alterações observadas em seus transcriptomas permitem inferir a função destes genes. Trata-se de um enorme salto na capacidade de entender a função dos genes no mar de complexidade dos milhares de genes sendo expressos nos mais variados tipos de células. Acesse o artigo original abaixo:

Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens.

Dixit A, Parnas O, Li B, Chen J, Fulco CP, Jerby-Arnon L, Marjanovic ND, Dionne D, Burks T, Raychowdhury R, Adamson B, Norman TM, Lander ES, Weissman JS, Friedman N, Regev A.

Cell. 2016 Dec 15;167(7):1853-1866.e17. doi: 10.1016/j.cell.2016.11.038.PMID: 27984732

“Droplet-Seq”: sequenciando o transcriptoma de dezenas de milhares de células, simultaneamente

Conheça a tecnologia do “Droplet-Seq” que está revolucionando a ciência. O Drop-seq analisa transcritos de mRNA de milhares de células individuais simultaneamente, lembrando a célula de origem dos transcritos.

De tempos em tempos a ciência é presenteada com inovações tecnológicas disruptivas. Foi assim com as novas tecnologias de sequenciamento de DNA (ou Next Generation Sequencing, ou NGS), que permitiram que o genoma humano fosse sequenciado num único equipamento e em poucas horas e por poucos milhares de dólares, ao invés dos 10 anos e 3 bilhões de dólares gastos pelo projeto do genoma humano e das centenas de sequenciadores clássicos (baseados no método de Sanger) utilizados pelos centros de sequenciamento. Com a tecnologia NGS, a capacidade de gerar bibliotecas para o sequenciamento do conjunto total de RNAs mensageiros (mRNAs) transcrito a partir dos genes ativos de uma única célula (seu transcriptoma, que codifica todas as proteínas da célula) permitiu que novas e importantes questões fossem feitas e respondidas. Apesar destes grandes avanços, até recentemente, na prática a possibilidade de se gerar bibliotecas de células únicas se restringia a apenas algumas dezenas ou centenas de células. A tecnologia do” Droplet-Seq” permite a geração de transcriptomas individuais de MILHARES de células de forma incrivelmente simples! Para isso, as células de um tecido são encapsuladas em pequenas gotículas, juntamente com todos os reagentes necessários para geração e identificação (com um “barcode” de DNA) dos cDNA derivados dos mRNAs de cada célula. Isto permite, por exemplo, que os pesquisadores saibam quais as células que estão presentes em um tumor (células do próprio câncer, do estroma, do sistema imune, etc), de forma que possam entender a biologia deste microambiente extremamente complexo e, eventualmente, descobrir novos caminhos para atacar o tumor e curar o paciente. Veja mais no artigo original abaixo (com abstracts gráficos e em vídeo):

https://marlin-prod.literatumonline.com/cms/attachment/4ee6c037-2624-4c29-9cff-2aa7eb7cbd4a/gr1_lrg.jpg
(A) Esquema de código de barras Drop-Seq. Um tecido complexo é dissociado em células individuais, que são então encapsuladas em gotículas juntamente com micropartículas (círculos cinzas) que fornecem primers codificados por códigos de barras. Cada célula é lisada dentro de uma gotícula; seus mRNAs se ligam aos primers da microparticula companheira. Os mRNAs são transcritos reversamente em cDNAs, gerando um conjunto de micropartículas chamadas “transcriptomas unicelulares ligados a micropartículas” (“single-cell transcriptomes attached to microparticles” ou STAMPs). Os STAMPs com código de barras podem então ser amplificados em conjuntos para sequenciamento (mRNA-seq) para analisar qualquer número desejado de células individuais.
(B) Sequência de iniciadores na micropartícula. Os primers em todas as esferas contêm uma seqüência comum (“PCR handle”) para permitir a amplificação por PCR após a formação do STAMP. Cada micropartícula contém mais de 10^8 primers individuais que compartilham o mesmo “cell barcode” (C), mas possuem diferentes identificadores moleculares (UMIs), permitindo que os transcritos de RNAm sejam contados digitalmente (D). Uma sequência oligo dT de 30 pb está presente no final de todas as sequências para captura dos mRNAs.
(C) Síntese do código de barras “Split-and-pool” da célula. Para gerar o código de barras da célula, o conjunto de micropartículas é repetidamente dividido em quatro reações de síntese de oligonucleótidos de tamanho igual, às quais uma das quatro bases do DNA é adicionada, e depois reunidas após cada ciclo, num total de 12 ciclos. O código de barras sintetizado em qualquer microparticula individual reflete o caminho único através da série de reações de síntese. O resultado é um conjunto de micropartículas, cada uma possuindo uma de 4^12 (16.777.716) sequências possíveis.
(D) Síntese do identificador molecular único (UMI). Após a conclusão dos ciclos de síntese “split-and-pool”, todas as micropartículas são submetidas a oito ciclos de síntese degenerada com todas as quatro bases de DNA disponíveis durante cada ciclo, de forma que cada iniciador individual recebe uma das 4^8 (65.536) sequências possíveis (UMIs).

Cell 2015 161, 1202-1214DOI: 10.1016/j.cell.2015.05.00

Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA.

Cell. 2015 May 21;161(5):1202-1214. doi: 10.1016/j.cell.2015.05.002.PMID: 26000488